Técnicas laboratoriais: amplificação cíclica de proteínas desnaturadas

      Para facilitar a detecção pré-clínica de priões em tecidos periféricos, foi desenvolvido, em 2001, um método de amplificação destas moléculas a partir, originalmente, de um homogenato cerebral, replicando o mecanismo de acção patogénica da doença e funcionado nos mesmo contornos de um PCR, somente sem a incubação de uma polimerase exterior.(23)

     A PrPSc é inoculada in vivo com PrPC, proporcionando a sua conversão e aglomeração em placas. A reacção de PMCA consiste em dois passos alternados, essencialmente, incubação e aplicação de ultra-sons. Acredita-se que sujeitas a ultra-sons, as moléculas de PrPSc fragmentam-se em porções mais pequenas, resultando numa multiplicação dos centros activos, que actuam nas moléculas de PrPC, durante a fase de incubação, recrutando-as e convertendo-as à forma infecciosa.(10) Actualmente, esta técnica é aplicada na detecção de quantidades diminutas de priões nos tecidos periféricos e sangue em fase subclínica, no estudo dos mecanismos de transmissão através de barreiras entre espécies, interferência da estirpe na prião na infecciosidade e acção dos cofactores auxiliares da conversão de PrPC.(8)

Ilustração 15 - Taxa de conversão relativa, por ciclo, com e sem contas.(10)

Ilustração 16 - Efeito inibitório da presença de contas nos problemas resultantes da presença de PrPres. (10)

         A eficiência no procedimento de amplificação depende de diversos factores(10), como tal, diferentes estratégias foram aplicadas no intuito de contrariar este efeito, nomeadamente um aumento no número de ciclos ou na concentração do substracto, fazendo partido da sobre-expressão de PrPC em ratos transgénicos; ou incubação na presença de contas de diâmetro na ordem dos 1,59 mm, que visam alcançar maiores taxas de conversão por ciclo, e contrariar o efeito negativo de PrPres na amplificação, entre outros propósitos. Está actualmente comprovado que qualquer tecido infectado serve de suporte a amplificação da proteína, apesar de revelarem taxas de reacção diferentes.

Ilustração 17- PMCA realizado em diferentes tipos celulares (8): neuronais (N2a),  células mesenquimais (SMB-PS), mistura cérebro/glia (CRBL) e fibroblastos (NIH 3T3)

Encontra-se, por via deste método, igualmente comprovada a presença de PrPres nas secreções lácticas de ovinos infectados, e a viabilidade do leite como amostra de teste. (27)