Apesar de notoriamente ultrapassada pelas actuais facilidades em detecção imunoquímica de PrP, a análise imunohistológica continua a apresentar-se como o método preferencial para diagnóstico clínico (5), com elevado grau de eficácia e especificidade na observação directa dos sintomas e sinais.
A eficiência da observação microscópica pode ser acrescida pela utilização de anticorpos de marcação imunoquímica de PrP.
Ilustração 13- Marcação imunohistoquímica, detecção microscópica (7)
a - Vacuolização e lesões espongiformes no núcleo dorsal motor do nervo Vago;
b – granulações de PrPd detectadas por técnicas microscópicas de marcação imunoquímica no núcleo olivar inferior).
Os resultados dependem em grande escala da preparação correta das amostras e dos anticorpos utilizados.(23)
O protocolo mais frequentemente aplicado na confirmação de casos clínicos consiste na incubação de modelos animais com um homogenato preparado a partir do tecido que se estime potencialmente afectado. (23)
A disponibilidade de roedores transgénicos que existe actualmente no mercado científico tornou relativamente fácil a manipulação do genoma de algumas espécies, o que permitiu que estas expressem em proporções aumentadas a proteína PrP, possibilitando um menor período de espera até à observação dos sintomas-tipo do quadro clínico de uma EET.
Estes modelos transgénicos, que expressam uma valina da região correspondente ao codão 129 do gene humano para a PrP, verificam-se altamente susceptíveis a priões de CJD, independentemente do tipo de PrPSC, ou genótipo, no codão 129, do indivíduo cuja amostra fora inoculada. Registam-se taxas de ataque primário da ordem dos 100%, com períodos de incubação por volta dos 200 dias. (24)
Ainda assim, devido aos cuidados implicados no desempenho do teste e ao tempo inerente à sua realização, este continua apenas a ser empregue para confirmação laboratorial, não se fazendo uso do mesmo para fins de detecção.
- Western Blotting
Ilustração 14- Assinatura de massas moleculares da PrP nas diferentes Scrapie (7)
(Legenda: *- Sem glicosilação;**- Monoglicosilada;***- Diglicosilada.)
Esta técnica, agora utilizada durante cerca de 20 anos, consiste na aplicação base da metodologia SDS-PAGE com uma digestão prévia por Proteinase K que, entre outros efeitos, degrada parcialmente a extremidade N-terminal da PrPres, provocando um “arrastamento” local da sua banda no gel. Trata-se de um método de elevada sensibilidade, utilizado à larga escala no diagnóstico de pacientes com vCJD.
O perfil de massas moleculares da Scrapie num gel difere consideravelmente da sua variante atípica, sendo a conformação-tipo da sua distribuição um grupo de 3 bandas (diglicosilada, monoglicosilada e sem glocosilação), enquanto a Scrapie atípica apresenta uma barra na zona abaixo de 12 kDa. (7) (5) (23)
- Sistema linforreticular
Como forma da aumentar a sensibilidade dos testes de diagnóstico post-mortem, ou até mesmo como ferramenta de diagnóstico ante-mortem, a análise de tecidos da mucosa linfóide apresenta-se como uma solução ainda pouco desenvolvida, tendo sido condenada por não se tratar de um método aplicável em testes rápidos de diagnóstico, pela dificuldade em ser exacto na realização de várias biópsias e possível insuficiência de folículos linfáticos; de igual forma, e por outro lado, as técnicas imunohistoquímicas permitem uma identificação mais rápida destas estruturas, como já explicado, fazendo uso da observação microscópica. (7)
Como ponto positivo, a acumulação de formas mutantes da PrP no SLR acontece numa fase pré-clínica, anterior à manifestação de quaisquer sintomas, mesmo antes da sua aglomeração no SNC. (5)
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